什么是流式細胞術？

流式細胞術（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是在流式細胞儀的基礎上，對處于快速直線流動狀態(tài)的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速定性、定量分析的一種高新技術，具有高通量、多參數(shù)、速度快，采集數(shù)據(jù)量大、操作靈活等優(yōu)點。最開始檢測單細胞內(nèi)DNA、RNA含量，蛋白質(zhì)或線粒體等大分子結構和細胞動力學，到如今拓展到細胞表面標志及抗原決定簇的研究、細胞抗原表達、免疫功能測定、細胞分選和鑒定、基因表達蛋白檢測、細胞內(nèi)細胞因子鑒定等多個研究領域，在市場上應用極為廣泛。

流式細胞儀

流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細胞術為核心技術，集光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術于一體的先進科學技術設備。是現(xiàn)代科學研究中的先進儀器之一，被譽為實驗室的”CT”。流式細胞儀主要由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)三部分組成。部分儀器在電子系統(tǒng)中具有分選功能，通過對粒子進行充電和偏轉，達到對細胞的分選并分析的目的。

流式細胞術原理

利用流式細胞術快速精確的對單個細胞的理化性質(zhì)進行定量分析和分選，主要通過幾個步驟：制備單細胞懸液，用特異性熒光染料標記的抗體進行染色，經(jīng)染色后的待測細胞在一定氣體壓力下被壓入流動室，在鞘液的包裹下細胞呈單行排列，依次通過檢測區(qū)域，在激光束的照射下細胞會產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號會同時被光電倍增管( PMT) 接收。接收后可轉換為電信號，通過模/數(shù)轉換器，將連續(xù)的電信號轉換為可被計算機識別的數(shù)字信號，進行分析。

流式細胞術實驗流程

單細胞懸液的制備

流式細胞術檢測的對象一般是細胞，并且是呈獨立狀態(tài)的懸浮于液體中的細胞。如果要檢測組織中的細胞，須先將組織制備成單細胞懸液。如果該培養(yǎng)細胞是貼壁細胞，需用胰酶消化處理；如果是胸腺、脾臟和淋巴結等外周免疫器官，直接將臟器用研磨制成單細胞懸液；如果是實體臟器（如肺臟、肝臟和腫瘤組），細胞之間結合較緊密，將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶進行細胞消化后再進行研磨。

熒光標記與上樣

細胞懸液制成后，用特異性熒光標記的抗體與細胞上的抗原結合以達到對細胞熒光標記（染色）。在恒定氣體的壓力下進入流動室，不含細胞或微粒的緩沖液（鞘液^[1]）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束，待測細胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。

激光照射及熒光信號收集

流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦的光束垂直照射在樣品流上，細胞上的熒光染料被激發(fā)，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

數(shù)據(jù)處理分析

熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原強度或細胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，光信號轉換為可被計算機識別的電信號。計算機把所測量的各種信號進行處理分析。

細胞分選

細胞分選是指根據(jù)所測定的各個參數(shù)將指定的細胞從細胞群體中分離出來，流式分選的不是細胞而是包裹了細胞的液滴。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產(chǎn)生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷（對標有熒光素的細胞液滴帶以負電荷；未標記熒光素的細胞液滴帶以正電荷；而不含有細胞的液滴則不被帶電荷），當液滴流經(jīng)偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不帶電荷的液滴落入廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。

實驗對照設置

合理的實驗對照是流式實驗成功的關鍵，下面介紹五種實驗中必備的實驗對照：

• 生物學對照：利用已知的陰性樣品和已知的陽性樣品設置對照。例如從文獻中查閱已知的表達/缺乏感興趣抗原表達的細胞，或使用RNAi或CRISPR技術將抗原敲除的細胞產(chǎn)生陰性細胞等。
• 空白對照：在流式上機檢測之前設置不加任何染料的細胞作為空白對照，得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光。
• 同型對照：Fc受體位于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞上。它們通過其恒定的Fc結構域結合抗體，這種結合會導致假陽性。為了防止這種類型的結合設置了加入FC受體封閉劑，再加入目標抗體的isotype作為同型對照，排除細胞FC受體造成的假陽性結果。
• 單染和補償對照：當進行多色流式實驗時，需要設置單染管進行補償調(diào)節(jié)。一般單染管要求有明顯的陽性細胞群，對于抗原表達弱的情況，則需要借助補償微球。

常見問題及分析

1. 細胞無染色或弱染色

• 細胞自發(fā)熒光較高：改變抗體的熒光染料形式。避開與自發(fā)熒光相同發(fā)射光的染料；
• 熒光染料淬滅：熒光抗體和熒光抗體染色后的樣本都應該避光保存；
• 激光器性能異常：使用流式細胞儀設定&跟蹤微球，以檢查激光的校準和功能；
• 數(shù)據(jù)過度補償：利用單染色對照和熒光減一對照為每次實驗設定補償；

2. 高背景或存在非特異性染色

• 二抗/試劑存在非特異性結合：滴定二抗，使本底降至最低程度，阻斷Fc受體，確保使用已經(jīng)被高度認可無非特異性的二抗；
• 抗體濃度過高：更改抗體的用量；
• 染色時間太長：根據(jù)實驗細胞表達，優(yōu)化抗體濃度和孵育時間；
• 洗滌不充分：增加染色后的洗滌次數(shù)；

3. 染色異常情況

• 使用同型對照濃度不對：使用與檢測抗體濃度相同的同型對照；
• 使用同型對照來自不同的廠家：使用與實驗抗體同一廠家生產(chǎn)的同型對照；
• 固定/破膜液影響細胞固定：調(diào)整FSC/SSC電壓，使細胞處于可視范圍之內(nèi)。

注釋：

[1] 鞘液：鞘液是無熒光本底的平衡電解質(zhì)溶液，主要成份為氯化鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸二鈉等，作為流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學特性進行分析時的緩沖液使用，目的是包裹細胞使細胞呈直線單行排列流入細胞儀檢測區(qū)域。