單克隆抗體制備中，成功獲得雜交細(xì)胞后，除對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化、擴(kuò)大培養(yǎng)外，也要及時(shí)凍存陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞，以免細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變、污染或出現(xiàn)細(xì)胞分泌抗體能力喪失等不良后果。
雜交瘤細(xì)胞的凍存實(shí)驗(yàn)步驟
- 將凍存液保存于4℃冰箱備用，凍存管高壓滅菌備用。
- 選擇生長(zhǎng)旺盛、飽滿透明的雜交瘤細(xì)胞，用無(wú)菌滴管吹下，2000r/min離心5min，棄去上清液。
- 將細(xì)胞沉淀物懸于預(yù)冷的細(xì)胞凍存液中，制成2～6×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。并分裝于細(xì)胞凍存管，每只1mL。
- 凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)，一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中；或細(xì)胞管降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中；也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。
雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)步驟
- 將水浴鍋預(yù)熱37℃，細(xì)胞培養(yǎng)液提前預(yù)熱，取5～10mL于15mL離心管中。
- 從液態(tài)氮中取出冷凍管，立即投入37℃水浴鍋中，輕輕搖動(dòng)，在1～1.5min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍。
- 取出后，用75%乙醇消毒管外壁，放入超凈臺(tái)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5～10ml不完全培養(yǎng)液的15ml離心管中， 800～1000r/min離心5min。
- 棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，移入事先準(zhǔn)備好的含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。
- 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，2～3天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí)，檢測(cè)抗體活性。
實(shí)驗(yàn)材料及儀器
實(shí)驗(yàn)材料及儀器
實(shí)驗(yàn)材料：穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)驗(yàn)儀器：無(wú)菌滴管，培養(yǎng)瓶等器材，冰箱、培養(yǎng)箱、離心機(jī)，超凈工作臺(tái)等設(shè)備。
培養(yǎng)液配方：
細(xì)胞凍存液：50%胎牛血清,10%二甲基亞砜,40%RPMI-1640培養(yǎng)基
細(xì)胞凍存液：50%胎牛血清,10%二甲基亞砜,40%RPMI-1640培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)液：20%胎牛血清,75%RPMI-1640培養(yǎng)基,1%谷氨酰胺,1%雙抗,最后用8.8%NaHCO3調(diào)培養(yǎng)液pH至7.2～7.4。
注意事項(xiàng)
- 凍存液最好預(yù)冷，操作時(shí)動(dòng)作要輕且迅速。
- 凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。
- 保證細(xì)胞培養(yǎng)液新鮮，采用少量多次配制，或培養(yǎng)基保存于-20℃冰箱。
- 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是慢凍快復(fù)，最大程度的保證細(xì)胞復(fù)蘇的成功率。