脾細(xì)胞的準(zhǔn)備：

1. 將Balb/c小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精3～5min。無(wú)菌操作取出脾臟，置于盛有5mL不完全培養(yǎng)液的平皿中，洗滌3次去除脾臟表面的脂肪和結(jié)締組織。
2. 將洗好的脾臟用剪刀剪成3～5個(gè)小塊，然后將脾臟研碎，過(guò)細(xì)胞篩，收集細(xì)胞。
3. 將脾臟細(xì)胞懸液在1000r/min條件下，離心5min，棄上清。再以同樣的方法洗滌離心一次。
4. 將沉淀細(xì)胞重新懸浮于10mL不完全培養(yǎng)液中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，取108個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

注意事項(xiàng)：

• 免疫脾細(xì)胞一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，因?yàn)榇藭r(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。

骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：

1. 選好骨髓瘤細(xì)胞株，取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞或體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤分離骨髓瘤細(xì)胞。
2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次。
3. 制備細(xì)胞懸液，計(jì)活細(xì)胞數(shù)。
4. 調(diào)整細(xì)胞濃度，取10⁷細(xì)胞懸液備用。

注意事項(xiàng)：

• 常用的骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
• 骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)生產(chǎn)大量McAb。
• 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20%。細(xì)胞的最大密度不得超過(guò)106個(gè)/mL。
• 一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1:10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16～20小時(shí)。
• 一般準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3～6個(gè)月應(yīng)用8～AG（8氮雜鳥(niǎo)嘌呤）篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。
• 保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。

細(xì)胞融合：

1. 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培養(yǎng)液。
2. 在1000r/min條件下離心8min，棄上清，用滴管輕輕吸凈殘留液體。
3. 用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細(xì)胞分散。
4. 將離心管置于37℃水浴中，吸取1mL預(yù)熱的50% PEG，緩慢滴入離心管內(nèi)，30秒內(nèi)加完，邊加邊輕輕攪拌，作用1～5min。
5. 沿管壁滴加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL和10mL，同時(shí)邊滴加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管。
6. 800r/min條件下離心5～10min，棄上清。
7. 將沉淀細(xì)胞輕輕混懸于含有20%的小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)液中，使細(xì)胞重懸。切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。
8. 根據(jù)96/24孔板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，然后將上述細(xì)胞接種至含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板（每孔1.0-1.5mL）或96孔培養(yǎng)板（每孔0.10～0.15mL）。
9. 接種完畢后，將上述培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

• 凍存的骨髓瘤細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合融合的狀態(tài)，培養(yǎng)目標(biāo)是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)間盡可能長(zhǎng)。
• 飼養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)在使用的前一天備好，這樣才能分泌足夠的細(xì)胞因子。

雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：

1. 一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。
2. 一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7～10天后，改用HT培養(yǎng)液。
3. 再維持2周后，可改用普通完全培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)：

• 經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
• 在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天要更換一半培養(yǎng)液。

篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞：

1. 包被抗原：將抗原以Na2CO3-NaHCO3緩沖液包被，使抗原濃度為10～20μL，加50～100μL/孔到96孔酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜或37℃包被2h，洗滌3次，拍干酶標(biāo)孔內(nèi)液體。同時(shí)，每板分別選取無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的兩孔為陰性對(duì)照，另選取無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的兩孔加入陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照。檢測(cè)血清或腹水效價(jià)時(shí)，對(duì)血清或腹水做倍比稀釋，100μL/孔，以正常小鼠血清為陰性對(duì)照，37℃孵育30min，洗滌3次，拍干。
2. 封閉：每孔加200μL或加滿封閉液（PBST溶解的1%BSA），于4℃過(guò)夜或37℃封閉2h后，洗滌3次，拍干，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/li>
3. 加抗血清：無(wú)菌條件下取細(xì)胞上清，每孔加入100μL不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2h，棄去孔內(nèi)液體，拍干。
4. 加酶標(biāo)二抗：加入PBST洗滌3次，每次5min，每孔加入100μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，拍干。
5. 顯色：加入顯色劑顯色15～20min，待顏色最深時(shí)用終止液終止反應(yīng)。
6. 讀數(shù)：在酶標(biāo)儀A450上讀出各孔OD值，選擇出陽(yáng)性孔。以各孔與陰性對(duì)照孔OD值的比值（P/M）大于2.1為限，作為判斷為陽(yáng)性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)。

注意事項(xiàng)：

• 在收集上清時(shí)，應(yīng)在上次換液后3～4天進(jìn)行，以便抗體積累。
• 上清可不經(jīng)稀釋或1:5～1:10稀釋后再測(cè)抗體活性，用稀釋抗體進(jìn)行篩選時(shí)可以篩掉弱陽(yáng)性的抗體，也可以去掉因高本底所造成的假陽(yáng)性。
• 一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)，需要有相應(yīng)的對(duì)照血清。
• 融合后第一次篩選出的陽(yáng)性克隆可能因陰性克隆或其他陽(yáng)性克隆的過(guò)度生長(zhǎng)而丟失，故應(yīng)盡早亞克隆。
• 第一次篩選后液可能沒(méi)篩選到陽(yáng)性抗體，這可能由于分泌陽(yáng)性抗體的細(xì)胞為數(shù)尚少，應(yīng)重復(fù)測(cè)定活性2～3次。
• 不同的顯色系統(tǒng)對(duì)應(yīng)不同的光吸收值。

雜交瘤細(xì)胞克隆化：

1. 制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）層。
2. 將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，并計(jì)數(shù)。
3. 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～10×103個(gè)/mL。
4. 取事先準(zhǔn)備的有飼養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，把96孔板分為4組，每組24孔，將細(xì)胞懸液按倍比稀釋法稀釋成4組細(xì)胞，即每組12.5、25、50、100個(gè)/mL，每孔加入100μL稀釋細(xì)胞，置于37℃、5%CO₂條件下進(jìn)行孵育。
5. 8～9天時(shí)，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測(cè)抗體活性。
6. 將陽(yáng)性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

• 初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。
• 細(xì)胞融合后，一旦經(jīng)鑒定可以產(chǎn)生目標(biāo)抗體，就應(yīng)立即進(jìn)行克隆化，確保能分離出單個(gè)細(xì)胞重新形成克隆。
• 應(yīng)在克隆前1天制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層。
• 在第7天換液，以后每2～3天換液1次。
• 陽(yáng)性克隆細(xì)胞應(yīng)盡快凍存。

單克隆抗體的大量制備：

1. 先腹腔注射0.5mL降脂烷或液體石蠟于BaLb/c鼠。
2. 培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50mL錐形離心管中，室溫下1000r/min條件下離心5min。
3. 將細(xì)胞重懸于50mL無(wú)菌的PBS或HBSS（不含F(xiàn)BS）中洗滌，1000r/min條件下離心5min，棄上清，重復(fù)2次，然后細(xì)胞重懸于5mL的PBS或HBSS中。
4. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力。
5. 用不含F(xiàn)BS的HBSS或PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10²個(gè)/mL。
6. 小鼠預(yù)處理1～2周后，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射2mL細(xì)胞。接種雜交瘤細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水。
7. 一只手抓住并固定小鼠，使其腹部繃緊，另一只手用滴管將腹水吸入試管中，或用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。
8. 室溫下，1500r/min條件下離心10min，收集上清，棄沉淀，將腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成。
9. 再次收集腹水前，讓小鼠再次積累腹水（2～3天），一般一只小鼠可獲1～10mL腹水，將幾天內(nèi)收集到的腹水混合，并于56℃水浴45min進(jìn)行熱處理，如果凝塊形成，可用牙簽挑出，然后再離心。

注意事項(xiàng)：

• 注射器進(jìn)針部位為左下腹或右下腹，避免刺入小鼠上腹的重要器官及腹中線處的主要大血管。
• 腹水中含有大量的油脂、巨噬細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、腹腔內(nèi)的上皮細(xì)胞、血液中的細(xì)胞成分等雜質(zhì)，應(yīng)先離心除去這些成分。
• 油脂的密度比較小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟掉即可。